En la actualidad, las diferentes técnicas moleculares ofrecen un sin fin de posibilidades en el ámbito de la Biología Marina. Una de ellas es la identificación de especies en base a su ADN. Este curso pretende mostrar desde un punto de vista teórico-práctico las técnicas de Biología Molecular usadas en los campos de taxonomía y filogenia marina.

El curso se divide en cuatro bloques predominantemente prácticos en los que también se explicarán los principales fundamentos teóricos. Así mismo, se expondrán problemas técnicos/metodológicos que se pueden encontrar en el día a día y posibles vías para su solución. El último bloque está orientado a familiarizar al alumno con la recepción y tratamiento de las secuencias. De este modo, el curso está diseñado para que los asistentes sean capaces de llevar a cabo sus propios análisis una vez éste finalice.

El objetivo principal de este curso es que los asistentes sean a capaces de llevar a cabo por si mismo las técnicas moleculares necesarias para la identificación de especies en base a su ADN. Para ello, a lo largo del curso y de sus cuatro bloques predominantemente prácticos, se realizará la extracción de ADN procedente de un organismo marino, la amplificación de determinadas regiones del genoma mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y su posterior visualización en un gel de electroforesis. Así mismo, los asistentes recibirán las nociones básicas para editar secuencias del tipo Sanger de los genes amplificados.

Los cuatro bloques en los que se divide este curso son:

1. Extracción de ADN: Los asistentes cortarán un pequeño trozo de tejido de un organismo marino conservado en etanol absoluto. A continuación, llevarán a cabo la extracción de ADN siguiendo el protocolo del kit de extracción DNeasy Blood and Tissue Kit de Qiagen (Qiagen, Valencia, CA, USA; 09/2001).

2. Amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Antes de proceder con la amplificación, comprobaremos la correcta extracción de ADN mediante el uso del espectrofotómetro Thermo Scientific NanoDrop. Posteriormente, los asistentes amplificarán secuencias parciales de los genes mitocondriales cytochrome c oxidase subunidad I (COI) y 16S rRNA (16S) y el gen nuclear Histona-3 (H3). Para ello se emplearán los siguientes cebadores universales: LCO1490 (5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’) y HCO2198 (5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAATCA-3’) para el COI; 16S ar-L (5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’) y 16S br-H (5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’) para el rRNA 16S; y H3AD5’3’ (5’- ATGGCTCGTACCAAGCAGACVGC-3’) y H3BD5’3’ (5’-ATATCCTTR GGCATRATRGTGAC-3’) para el H3.

3. Visualización de los resultados mediante electroforesis: Antes de enviar los productos de PCR a secuenciar, es necesario saber si se ha llevado a cabo la amplificación de la región del genoma que se desea. Por ello, parte del producto amplificado se someterá a una electroforesis en la cual se podrán observar las diferencias en el número de pares de bases amplificadas.

4. Secuenciación, recepción y edición de secuencias: Para conocer el proceso de secuenciación, se realizará una visita al secuenciador de los Servicios Centrales de la Universidad de Cádiz. Así mismo, los asistentes recibirán las nociones básicas para editar “raw” secuencias del tipo Sanger e identificar si hay contaminación.